煙堿型乙酰膽堿受體α5促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌轉(zhuǎn)移
神經(jīng)遞質(zhì)啟動(dòng)的信號(hào)通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性表型中發(fā)揮著重要作用。靶向失調(diào)的神經(jīng)系統(tǒng)可能是癌癥治療的一種新策略。
2024年3月8日，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科教授欽倫秀、董瓊珠團(tuán)隊(duì)在 Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=40.3）上發(fā)表題為“Alpha5 nicotine acetylcholine receptor subunit promotes intrahepatic cholangiocarcinoma metastasis”的研究論文[1]。該研究發(fā)現(xiàn)，KN93——鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶（CAMKII）的小分子抑制劑，可顯著抑制肝內(nèi)膽管癌（ICC）細(xì)胞的遷移，增強(qiáng)對(duì)吉西他濱的敏感性。乙酰膽堿（ACh）/煙堿型乙酰膽堿受體α5（CHRNA5）軸通過CAMKII/GSK3β信號(hào)通路增加β-catenin的表達(dá)，促進(jìn)ICC轉(zhuǎn)移和對(duì)吉西他濱的耐藥。該研究提示KN93與吉西他濱聯(lián)合使用可能是一種新的ICC治療策略。
文章解析
1.研究背景
膽管癌（CCA）是一種發(fā)生在膽道不同部位的上皮細(xì)胞惡性腫瘤。根據(jù)解剖位置，CCA分為肝內(nèi)膽管癌（ICC）、肝門周圍膽管癌（pCCA）和遠(yuǎn)端膽管癌（dCCA）三種亞型，分別具有不同的腫瘤表現(xiàn)、臨床特征、治療方案和預(yù)后。手術(shù)治療是所有亞型的首選，吉西他濱和順鉑的化療方案經(jīng)常用于無法手術(shù)的患者治療。但CCA的高度促結(jié)締組織增生性、復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境以及遺傳異質(zhì)性，都導(dǎo)致了其治療耐藥性。CCA預(yù)后極差，5年總生存率為5%-20%，而ICC約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的5-10%，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。進(jìn)一步探索ICC生物學(xué)、致癌環(huán)境及其與腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜相互作用，從而開發(fā)新的治療策略，顯得尤為重要。
神經(jīng)周圍浸潤(rùn)（PNI），指的是癌細(xì)胞出現(xiàn)在神經(jīng)鞘的任何層或周圍至少33%的神經(jīng)纖維周長(zhǎng)，在包括ICC在內(nèi)的許多實(shí)體惡性腫瘤中都有提及。越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展的調(diào)節(jié)中起著核心作用。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF），是參與神經(jīng)元生長(zhǎng)和PNI的蛋白質(zhì)。
在神經(jīng)發(fā)育過程中，BDNF激活TrKB信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)的生長(zhǎng)。既往研究發(fā)現(xiàn)，BDNF在ICC中的表達(dá)明顯高于鄰近正常組織，且BDNF水平與PNI的發(fā)生呈正相關(guān)，提示BDNF可能在ICC中PNI的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。
乙酰膽堿（ACh）是一種典型的神經(jīng)遞質(zhì)，據(jù)報(bào)道可促進(jìn)甲狀腺癌和胃癌的干性和進(jìn)展。煙堿型乙酰膽堿受體（N-AChR）是對(duì)ACh產(chǎn)生響應(yīng)的受體之一，作為N-AChR家族的一員，煙堿型乙酰膽堿受體α5-nAChR（CHRNA5）是可與α4β2受體形成絡(luò)合物，從而在ACh存在下提高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，既往研究表明CHRNA5的異常表達(dá)與尼古丁成癮和肺癌的惡性表型密切相關(guān)。但人們對(duì)CHRNA5在ICC中的作用知之甚少。
2.研究?jī)?nèi)容
1、ACh通過誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）促進(jìn)ICC轉(zhuǎn)移
PNI被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的一種侵襲行為。研究團(tuán)隊(duì)通過分析本院152例患者的預(yù)后信息發(fā)現(xiàn)PNI是ICC不良預(yù)后的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子，最終入組了127對(duì)膽管癌和鄰近正常組織樣本。
通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)ICC中去甲腎上腺素（NE）和ACh的含量，發(fā)現(xiàn)PNI+ ICC中ACh水平明顯高于PNI-ICC，而NE濃度無明顯差異（圖1a和補(bǔ)充圖2b）。此外，免疫熒光染色分析還顯示，ICC組織中大部分PGP9.5陽(yáng)性的神經(jīng)纖維對(duì)副交感神經(jīng)標(biāo)記物-囊泡乙酰cho線轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（VAChT）呈陽(yáng)性，只有少數(shù)神經(jīng)纖維對(duì)交感神經(jīng)標(biāo)記物酪氨酸羥化酶（TH）呈陽(yáng)性（圖1b）。這些結(jié)果提示PNI在ICC中創(chuàng)造了一個(gè)富含ACh的微環(huán)境。體外實(shí)驗(yàn)顯示，外源性ACh顯著刺激了EMT表型，增強(qiáng)了ICC細(xì)胞的遷移能力（圖1c，d和補(bǔ)充圖2c-f），而NE處理后無明顯影響（補(bǔ)充圖2g）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還顯示，ACh處理顯著促進(jìn)了CCLP1細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的形成（圖1e，f），及鹽酸苯胺顯著抑制肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的形成（補(bǔ)充圖2k，l）。這些結(jié)果表明，神經(jīng)源性ACh在刺激ICC細(xì)胞EMT表型中起關(guān)鍵作用。
既往研究報(bào)道，ACh除由神經(jīng)分泌外，還可由癌細(xì)胞自行合成。有趣的是，ELISA法在HuCCT1和CCLP1細(xì)胞培養(yǎng)上清中也檢測(cè)到ACh（圖1g），鹽酸苯胺處理顯著抑制ICC細(xì)胞的體外遷移能力（圖1h），提示ICC細(xì)胞可能能夠自我合成和分泌ACh來促進(jìn)遷移。該研究發(fā)現(xiàn)對(duì)ACh合成至關(guān)重要的膽堿乙?；福–hAT）在ICC細(xì)胞系中呈陽(yáng)性（補(bǔ)充圖2），并且入組隊(duì)列中約35%（44/127個(gè)ICC患者）的ChAT呈陽(yáng)性（圖11）。通過敲除ICC細(xì)胞中的ChAT（補(bǔ)充圖2n），發(fā)現(xiàn)ChAT敲除顯著降低了ICC細(xì)胞的ACh分泌（圖1j），抑制了ICC細(xì)胞的遷移能力，外源性ACh的加入減弱了ICC細(xì)胞的遷移能力（圖1k）。
這些數(shù)據(jù)表明，來自神經(jīng)分泌或ICC細(xì)胞自我合成的ACh誘導(dǎo)EMT表型，促進(jìn)ICC轉(zhuǎn)移。
2、體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)阻斷ACh/CHRNA5軸可抑制ICC的惡性表型
在入組隊(duì)列患者中，免疫組化染色（IHC）結(jié)果顯示，與非腫瘤膽管相比，ICC組織中CHRNA5的表達(dá)水平更高（圖2a），且CHRNA5表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平密切相關(guān)，高CHRNA5表達(dá)的ICC患者OS和DFS顯著縮短（圖2b和補(bǔ)充圖3g）。這些表明，CHRNA5與ICC的惡性表型顯著相關(guān)。通過敲除CHRNA5，檢測(cè)其在CCLP1中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)它顯著抑制ICC細(xì)胞的EMT表型（圖2c，d和補(bǔ)充圖3j），并消除了ACh誘導(dǎo)的ICC細(xì)胞的EMT表型（圖2e和補(bǔ)充圖3k），也減弱了DRG對(duì)ICC細(xì)胞遷移能力的刺激作用（補(bǔ)充圖3l）。在HuCCT1中過表達(dá)CHRNA5（補(bǔ)充圖3m，n），發(fā)現(xiàn)它可以增強(qiáng)ICC的EMT表型（圖2f，g和補(bǔ)充圖3o）。有趣的是，敲除ChAT可以抑制CHRNA5對(duì)ICC細(xì)胞遷移能力的增強(qiáng)作用，而這種增強(qiáng)作用可以通過外源添加ACh來恢復(fù)（圖2h，i）。這些結(jié)果表明，ACh/CHRNA5軸在促進(jìn)ICC細(xì)胞遷移能力中起著關(guān)鍵作用。
為了進(jìn)一步評(píng)估ACh/CHRNA5軸在體內(nèi)的意義，研究團(tuán)隊(duì)利用ICC細(xì)胞建立了肝門原位植入模型。CHRNA5敲除顯著減輕了裸鼠腫瘤性梗阻黃疸（圖2j和補(bǔ)充圖4a，b）；CHRNA5過表達(dá)顯著加重了腫瘤性梗阻黃疸（圖2k和補(bǔ)充圖4c，d）。同樣，CHRNA5敲除顯著減少了裸鼠脾移植ICC細(xì)胞后肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量（圖2l和補(bǔ)充圖4e，f）；CHRNA5過表達(dá)增加了肝轉(zhuǎn)移數(shù)量（圖2m和補(bǔ)充圖4g，h）。然后，研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建坐骨神經(jīng)侵襲模型，進(jìn)一步研究ACh/CHRNA5軸在體內(nèi)對(duì)ICC侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，CHRNA5敲除降低了ICC細(xì)胞對(duì)坐骨神經(jīng)軸突的包繞能力，以及侵襲神經(jīng)纖維鞘的能力（圖2n和補(bǔ)充圖4i，j），這表明CHRNA5敲除剝奪了ICC的侵襲能力。另一方面，CHRNA5過表達(dá)增強(qiáng)了ICC的體內(nèi)侵襲能力（圖2o和補(bǔ)充圖4k，1）。此外，6例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ICC患者的原發(fā)和轉(zhuǎn)移灶配對(duì)樣本的IHC結(jié)果顯示，CHRNA5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)明顯高于原發(fā)灶（補(bǔ)充圖4m）。研究人員還構(gòu)建了YAP/Akt驅(qū)動(dòng)的ICC小鼠模型（補(bǔ)充圖4n），發(fā)現(xiàn)YAP/ akt驅(qū)動(dòng)的腫瘤CK19陽(yáng)性，HNF4α陰性（補(bǔ)充圖40），與ICC的歷史病理特征一致。鹽酸苯胺治療顯著降低了腫瘤負(fù)荷（補(bǔ)充圖4p，q），延長(zhǎng)了YAP/Akt ICC小鼠的生存時(shí)間（圖2p）；也降低了Ki67的表達(dá)水平，并抑制了YAP/ akt驅(qū)動(dòng)的ICC中EMT表型（補(bǔ)充圖4r）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)支持ACh/CHRNA5軸在維持ICC的惡性表型中起關(guān)鍵作用，阻斷該軸在體外和體內(nèi)均顯示出對(duì)惡性表型的抑制作用。
圖2.阻斷ACh/CHRNA5抑制ICC進(jìn)展（源自論文[1]）
3、β-catenin信號(hào)通路是由ACh/CHRNA5軸驅(qū)動(dòng)的惡性表型
考慮到β-catenin信號(hào)通路在腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，研究團(tuán)隊(duì)提出ACh/ CHRNA5軸可能通過β-catenin調(diào)控ICC的EMT表型。結(jié)果顯示ICC細(xì)胞和異種移植組織中β-catenin水平相應(yīng)地隨著CHRNA5的表達(dá)而升高或降低（圖3a和補(bǔ)充圖5d）。臨床ICC組織的IHC結(jié)果也證實(shí)了CHRNA5與β-catenin蛋白水平的正相關(guān)（圖3b）。此外，外源添加ACh可增加β-catenin的表達(dá)（補(bǔ)充圖5e），ACh受體抑制劑可降低YAP/Akt小鼠模型ICC組織中β-catenin的表達(dá)（圖3c）。CHRNA5的上調(diào)或下調(diào)伴隨著ICC細(xì)胞細(xì)胞核中β-catenin蛋白水平的相應(yīng)升高或降低（圖3d，e）。這些結(jié)果表明ACh/CHRNA5軸在β-catenin表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用。
先前的研究報(bào)道了β-catenin在化療耐藥中的關(guān)鍵作用，該研究也發(fā)現(xiàn)CHRNA5敲除顯著增加了對(duì)吉西他濱的反應(yīng)（圖3f），而CHRNA5過表達(dá)導(dǎo)致了ICC細(xì)胞對(duì)吉西他濱的耐藥（圖3g）。此外，β-catenin過表達(dá)部分中和了CHRNA5敲除對(duì)CHRNA5沉默的CCLP1細(xì)胞中EMT表型的抑制作用（圖3h，i），而在CHRNA5過表達(dá)的HuCCT1細(xì)胞中，沉默β-catenin后觀察到相反的效果（圖3j，k）。這些結(jié)果表明，ACh/CHRNA5軸介導(dǎo)的ICC EMT表型可能部分歸因于β-catenin信號(hào)通路。
4.ACh/CHRNA5軸介導(dǎo)的CAMKII激活抑制GSK-3β活性以穩(wěn)定β-catenin
研究團(tuán)隊(duì)隨后探索了ACh/CHRNA5軸調(diào)控β-catenin表達(dá)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)CHRNA5對(duì)β-catenin mRNA表達(dá)沒有顯著影響（補(bǔ)充圖6a, b）。檢測(cè)了環(huán)己亞胺（CHX）處理ICC細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的β-catenin蛋白水平，發(fā)現(xiàn)下調(diào)CHRNA5可顯著縮短β-catenin的半衰期（圖4a）；而CHRNA5過表達(dá)顯著延長(zhǎng)了β-catenin的半衰期（圖4b）。此外，蛋白酶體抑制劑MG132顯著恢復(fù)了CCLP1-shCHRNA5細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)（補(bǔ)充圖6c）。這表明CHRNA5可能通過蛋白酶體介導(dǎo)的途徑調(diào)節(jié)β-catenin的降解。
接下來研究CHRNA5是否參與β-catenin磷酸化的調(diào)控。結(jié)果證明CHRNA5參與調(diào)節(jié)β-catenin在T41, S33, S37位點(diǎn)的磷酸化（圖4c）和GSK3β活性（補(bǔ)充圖6d, e）。上調(diào)或下調(diào)CHRNA5導(dǎo)致相應(yīng)的GSK3β Ser9磷酸化升高或降低（圖4d）。這表明CHRNA5可能通過誘導(dǎo)GSK3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化來調(diào)節(jié)其活性。GSK3β抑制劑LiCl，可減弱CHRNA5敲除對(duì)β-catenin活性和ICC遷移能力的抑制作用（圖4e，f）。進(jìn)一步在CHRNA5過表達(dá)的HuCCT1細(xì)胞中過表達(dá)突變的GSK3β（S9A）蛋白中，觀察到GSK3β（S9A）蛋白對(duì)ICC細(xì)胞β-catenin表達(dá)和遷移能力的抑制作用比野生型GSK3β蛋白更顯著（圖4h）。這些都表明，CHRNA5通過誘導(dǎo)GSK3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化使其失活，從而進(jìn)一步增加了β-catenin蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)ICC轉(zhuǎn)移。
通過免疫共沉淀法和質(zhì)譜分析，確定CAMKII是與GSK3β相互作用的候選蛋白（補(bǔ)充圖6f），并推測(cè)CAMKII可能在ACh/CHRNA5軸介導(dǎo)的GSK3β Ser9磷酸化中發(fā)揮重要作用。CAMKII活性與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度密切相關(guān)，ACh/ CHRNA5軸顯著增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（補(bǔ)充圖6g）。此外，CHRNA5下調(diào)或上調(diào)誘導(dǎo)CAMKII活性顯著降低或增加（圖4i；補(bǔ)充圖6h），鹽酸苯胺處理顯著降低了YAP/Akt ICC小鼠的p-CAMKII水平（補(bǔ)充圖6i）。此外，共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明CAMKII可以與野生型GSK3β相互作用，而不是與Ser9突變型GSK3β（S9A）相互作用（圖4j）。CAMKII蛋白與GSK3β結(jié)合的量通過敲除CHRNA5而顯著減少，并通過CHRNA5過表達(dá)而增加（圖4k）。同樣，CAMKII抑制劑KN93顯著降低了ICC中p-GSK3β（S9）和β-catenin的表達(dá)（圖4l），并顯著抑制ICC的EMT表型（補(bǔ)充圖6j，k）。這些發(fā)現(xiàn)表明，ACh/CHRNA5軸可以激活CAMKII，從而抑制GSK-3β活性，穩(wěn)定β-catenin。
圖4.ACh/CHRNA5軸介導(dǎo)的CAMKII激活抑制GSK-3β活性以穩(wěn)定β-catenin（源自論文[1]）
5、ACh/CHRNA5軸促進(jìn)ICC分泌BDNF，誘導(dǎo)軸突發(fā)生
ACh信號(hào)傳導(dǎo)曾被報(bào)道在胃癌中誘導(dǎo)軸突發(fā)生。為了探索ACh信號(hào)是否能誘導(dǎo)ICC軸突發(fā)生，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過IHC檢測(cè)ICC異種移植物中PGP9.5的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)CHRNA5會(huì)導(dǎo)致ICC異種移植物腫瘤軸突發(fā)生相應(yīng)的增加或減少（圖5a, b）。乙酰膽堿受體抑制劑顯著降低YAP/Akt小鼠的軸原分泌（補(bǔ)充圖7a）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ACh/ CHRNA5軸在體外軸突發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用，收集ICC細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理DRG，采用免疫熒光染色法檢測(cè)DRG軸突新生情況。結(jié)果顯示，在CCLP1細(xì)胞中，CHRNA5敲低顯著降低了誘導(dǎo)神經(jīng)突生長(zhǎng)的能力（圖5c），但在HuCCT1細(xì)胞中，CHRNA5過表達(dá)增強(qiáng)了誘導(dǎo)神經(jīng)突生長(zhǎng)的能力（圖5d），這表明ACh/CHRNA5軸參與了ICC軸突發(fā)生的調(diào)節(jié)。
隨后探討了ACh/CHRNA5軸如何調(diào)節(jié)ICC的軸突發(fā)生。由于BDNF通過激活TrKB受體在軸突發(fā)生中發(fā)揮重要作用，研究團(tuán)隊(duì)檢測(cè)了BDNF在ICC細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在敲除CHRNA5后，BDNF的表達(dá)水平顯著降低（圖5e；補(bǔ)充圖7g），并且CHRNA5過表達(dá)顯著增加BDNF水平（圖5f；補(bǔ)充圖7h）。這些結(jié)果與ELISA檢測(cè)的ICC異種移植組織中的結(jié)果一致（補(bǔ)充圖7i, j）。此外，乙酰膽堿受體抑制劑顯著降低了YAP/Akt ICC小鼠的BDNF水平（補(bǔ)充圖7k）。BDNF受體抑制劑ANA-12顯著抑制了CHRNA5增加ICC軸突發(fā)生的能力（補(bǔ)充圖 7l），表明BDNF在CHRNA5促進(jìn)ICC軸突發(fā)生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。ANA-12可顯著降低YAP/Akt ICC小鼠的腫瘤負(fù)荷（補(bǔ)充圖7m）、軸突發(fā)生以及p-CAMKII和β-catenin的表達(dá)水平（圖5g）。這表明，ACh/CHRNA5軸介導(dǎo)的BDNF上調(diào)促進(jìn)了神經(jīng)的生長(zhǎng)，相應(yīng)地，神經(jīng)可以進(jìn)一步提高ACh/CHRNA5軸及其下游CAMKII/GSK3β/β-catenin信號(hào)的活性，從而形成一個(gè)正反饋回路，促進(jìn)ICC的進(jìn)展。
研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)β-catenin抑制劑ICG- 001顯著抑制ICC細(xì)胞中BDNF的表達(dá)水平（圖5h, i），與之前報(bào)道的β-catenin可啟動(dòng)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中BDNF轉(zhuǎn)錄表達(dá)的觀點(diǎn)相一致。因此，研究團(tuán)隊(duì)猜測(cè)ACh/CHRNA5軸可能通過β-catenin調(diào)節(jié)BDNF的表達(dá)水平?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)CTNNB1與ICC中的BDNF呈正相關(guān)（補(bǔ)充圖7n）。CTNNB1的敲除降低了BDNF的表達(dá)水平（圖5j）；CTNNB1的過表達(dá)增加了ICC中BDNF的表達(dá)水平（圖5k）；CAMKII抑制劑KN93降低了BDNF的表達(dá)，而GSK3β抑制劑增加了BDNF的表達(dá)（補(bǔ)充圖7o），表明CAMKII/ GSK3β/β-catenin信號(hào)通路在BDNF的表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用。上述所有這些結(jié)果提示在ICC中，ACh/CHRNA5軸介導(dǎo)的β-catenin上調(diào)上調(diào)BDNF的表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)的生長(zhǎng)，而神經(jīng)又進(jìn)一步激活I(lǐng)CC中ACh/CHRNA5軸，在ICC細(xì)胞和神經(jīng)之間形成正反饋回路，促進(jìn)ICC的進(jìn)展。為進(jìn)一步鞏固此結(jié)論，研究團(tuán)隊(duì)通過多重免疫組化（mIHC）實(shí)驗(yàn)探討了p-CAMKII、p-GSK3β、β-catenin、BDNF和PGP9.5在人ICC樣本中的表達(dá)情況。mIHC結(jié)果顯示，p-CAMKII、p-GSK3β、β-catenin和BDNF的表達(dá)在靠近神經(jīng)的ICC細(xì)胞中顯著升高（圖5l），提示神經(jīng)可能介導(dǎo)ICC中CAMKII/GSK3β/β-catenin信號(hào)的激活，并增加BDNF的表達(dá)，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)神經(jīng)的生長(zhǎng)。
圖5.ACh/CHRNA5軸促進(jìn)ICC分泌BDNF，誘導(dǎo)軸突發(fā)生（源自論文[1]）
6、CAMKII抑制劑KN93和吉西他濱聯(lián)合治療在ICC中顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤活性
鑒于CAMKII在調(diào)節(jié)β-catenin活性中發(fā)揮重要作用，而β-catenin是ICC化療敏感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，于是研究團(tuán)隊(duì)猜想CAMKII活性可能與ICC的化療反應(yīng)密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探索CAMKII活性與ICC患者吉西他濱療效的潛在相關(guān)性，研究團(tuán)隊(duì)收集了19例接受吉西他濱為基礎(chǔ)化療的ICC患者樣本。IHC結(jié)果顯示對(duì)吉西他濱化療耐藥的ICC患者p-CAMKII表達(dá)水平較高（圖6a），提示CAMKII可能作為ICC的治療靶點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，CAMKII抑制劑KN93可增加吉西他濱的敏感性（圖6b），KN93與吉西他濱具有協(xié)同抗腫瘤作用（圖6c）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了KN93和吉西他濱聯(lián)合治療比單藥治療更有效（圖6d，e），并且在接受不同治療的小鼠中未觀察到這些藥物的明顯毒性（圖6f）。此外，聯(lián)合用藥能更大程度地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制Ki67的表達(dá)（圖6g，h）。綜上，抑制CAMKII可抑制ICC的惡性表型并增加其對(duì)吉西他濱的敏感性，KN93聯(lián)合吉西他濱可能是治療ICC的一種新的治療策略。
本研究涉及的mIHC實(shí)驗(yàn)中TSA染料來自艾克發(fā)生物的AlphaXTSA®多靶點(diǎn)免疫組化染色試劑盒（5標(biāo)6色XTSA480/XTSA520/XTSA570/XTSA620/XTSA690），標(biāo)記CK19/PGP9.5/P-CAMK II/P-GSK3β/β-catenin/BDNF蛋白，直觀檢測(cè)顯示不同靶標(biāo)的表達(dá)情況。
總結(jié)
本研究利用127對(duì)ICC癌和正常組織樣本，并建立裸鼠異種移植瘤模型和肝轉(zhuǎn)移模型，通過RNA-seq、mIHC、ELISA等技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)ICC細(xì)胞和浸潤(rùn)的神經(jīng)可以形成富含ACh的腫瘤微環(huán)境，ACh通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)ICC轉(zhuǎn)移。ACh通過與CHRNA5的相互作用促進(jìn)ICC轉(zhuǎn)移。ACh/CHRNA5軸部分通過Ca2+介導(dǎo)的CAMKII的激活來激活GSK3β/β-catenin信號(hào)通路。此外，ACh信號(hào)激活還通過增加BDNF的表達(dá)來擴(kuò)大神經(jīng)浸潤(rùn)，BDNF形成前饋ACh-BDNF軸以促進(jìn)ICC進(jìn)展。KN93是CaMKII的小分子抑制劑，可顯著抑制ICC細(xì)胞的遷移，增強(qiáng)其對(duì)吉西他濱的敏感性。總體結(jié)果提示KN93與吉西他濱聯(lián)合使用可能是一種新的ICC治療策略，特別是對(duì)PNI患者。
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